Nuôi cấy mô và nhân giống IN VITRO

Nuôi cấy mô (tissue culture) là thuật ngữ dùng để chỉ quá trình nuôi cấy vô trùng in vitro các bộ phận tách rời khác nhau của thực vật. Kỹ thuật nuôi cấy mô dùng cho cả hai mục đích nhân giống và cải thiện di truyền (ví dụ: giống cây trồng), sản xuất sinh khối các sản phẩm hóa sinh, bệnh học thực vật, duy trì và bảo quản các nguồn gen quý… Các hoạt động này được bao hàm trong thuật ngữ công nghệ sinh học.

Thuật ngữ nhân giống in vitro (in vitro propagation) hay còn gọi là vi nhân giống (micropropagation) được sử dụng đặc biệt cho việc ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, bắt đầu bằng nhiều bộ phận khác nhau của thực vật có kích thước nhỏ, sinh trưởng ở điều kiện vô trùng trong các ống nghiệm hoặc trong các loại bình nuôi cấy khác.

Trong thực tế, các nhà vi nhân giống (micropropagators) dùng thuật ngữ nhân giống in vitro và nuôi cấy mô thay đổi cho nhau để chỉ mọi phương thức nhân giống thực vật trong điều kiện vô trùng. Thuật ngữ đồng nghĩa là nuôi cấy in vitro (in vitro culture).

Nhân giống in vitro và nuôi cấy mô bắt đầu bằng các mảnh cắt nhỏ của thực vật, sạch vi sinh vật, và được nuôi cấy vô trùng. Thuật ngữ đầu tiên dùng trong quá trình nhân giống là explant (mẫu vật) tương đương với các phương thức nhân giống khác là cutting (cành giâm), layer (cành chiết), scion (cành ghép) hoặc seed (hạt).

Năm thuật ngữ khác được dùng để chỉ các loại tái sinh sinh dưỡng (vegetative or somatic regeneration) cơ bản trong nhân giống in vitro và nuôi cấy mô:

1.1. Nuôi cấy đỉnh phân sinh ( meristem-tip culture )
Phương thức nhân giống bằng cách dùng những phận rất nhỏ của đỉnh chồi ( shoot-tip ) gồm có mô phân sinh đỉnh riêng rẽ ( single apical meristem ) và mầm lá non ( young leaf primordia ) để lê dài chồi ( shoot elongation ) ngay sau đó. Kiểu nuôi cấy này được dùng lần tiên phong để làm sạch virus ( virus-free ) ở thực vật. Nếu dùng đỉnh phân sinh không hề sống sót và tạo rễ một cách độc lập, thì hoàn toàn có thể thay thế sửa chữa bằng phương pháp vi ghép ( micrografting ) .
Thành công nổi bật trong phương pháp này là nhân giống những cây một lá mầm như hoa lan, dứa, huệ và chuối ( protocorm hoặc cụm chồi ) … hoặc cây hai lá mầm như khoai tây, cà chua và cúc ( lê dài chồi ) …
1.2. Sinh sản chồi nách ( axillary shoot proliferation )

Kiểu nuôi cấy này sử dụng chồi của các điểm sinh trưởng bên và ngọn nơi mà sự kéo dài của chồi ngọn (elongation of terminal shoot) bị kìm hãm và sự sinh sản chồi nách được đẩy mạnh. Sự điều khiển này cho phép nhân nhanh được các chồi in vitro (microshoots), là các chồi có thể tách ra và tạo rễ in vitro để hình thành cây trong ống nghiệm (microplants), hoặc nó có thể được cắt ra riêng biệt tạo thành các cành giâm in vitro (microcuttings) để tạo rễ bên ngoài in vitro.

Phương thức này thường được vận dụng cho những đối tượng người tiêu dùng hai lá mầm như cúc, cà chua, thuốc lá …
1.3. Tạo chồi bất định ( adventitious shoot induction )
Loại nuôi cấy được cho phép hình thành những chồi bất định hoặc trực tiếp trên vật mẫu hoặc gián tiếp từ mô callus, mà mô callus này hình thành trên mặt phẳng vết cắt của vật mẫu. Hệ thống nuôi cấy này có những nhu yếu tương tự như với nuôi cấy mô phân sinh đỉnh, nó chỉ khác về nguồn vật mẫu và nguồn gốc bất định của những chồi mới. Một số loại vật mẫu được dùng như là đoạn thân ( thuốc lá, cam, chanh, cà chua, bắp cải ), mảnh lá ( thuốc lá, cà chua, bắp cải, cafe, ca cao ), cuống lá ( thủy tiên ), những bộ phận của hoa ( súp lơ, lúa mì, thuốc lá ), nhánh củ ( họ hành, họ lay ơn, họ thủy tiên ), đoạn mầm ( măng tây ) …
1.4. Phát sinh cơ quan ( organogenesis )

Thuật ngữ này dùng để mô tả quá trình tái sinh các chồi hoặc/và rễ bất định từ các khối tế bào callus. Quá trình này xảy ra sau thời điểm mà mẫu vật được đặt vào môi trường nuôi cấy và sự bắt đầu cảm ứng tạo callus. Đối với mục đích nhân giống in vitro, nếu tái sinh được cây hoàn chỉnh trực tiếp từ mẫu vật nuôi cấy ban đầu thì không những nhanh chóng thu được cây mà các cây cũng khá đồng nhất về mặt di truyền. Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp mô nuôi cấy không tái sinh cây ngay mà phát triển thành khối callus. Tế bào callus khi cấy chuyển nhiều lần sẽ không ổn định về mặt di truyền. Để tránh tình trạng đó nhất thiết phải sử dụng loại callus vừa phát sinh, tức là callus sơ cấp để tái sinh cây thì hy vọng sẽ thu được cây tái sinh đồng nhất.

1.5. Phát sinh phôi vô tính ( somatic embryogenesis )

Thuật ngữ này dùng cho sự phát triển của các phôi hoàn chỉnh từ các tế bào sinh dưỡng được sản xuất từ các nguồn mẫu vật khác nhau sinh trưởng trong nuôi cấy in vitro. Thuật ngữ tương đương đối với sự phát triển phôi ở thực vật sinh trưởng trong điều kiện tự nhiên là phát sinh phôi hữu tính (zygotic embryogenesis) và phát sinh phôi vô tính (apomitic embryogenesis). Phôi vô tính có cấu trúc tương tự phôi hữu tính của thực vật sinh trưởng trong điều kiện tự nhiên. Điểm khác nhau cơ bản giữa phôi hữu tính và phôi vô tính là phôi hữu tính luôn luôn đi kèm với nội nhũ là cơ quan dự trữ năng lượng và chất dinh dưỡng phục vụ cho quá trình nảy mầm, còn ở phôi vô tính hoàn toàn không có nội nhũ. Phương thức tạo phôi vô tính được ứng dụng rất hiệu quả trong sản xuất hạt nhân tạo (synthetic seeds).

2. Nhân giống in vitro và các hệ thống nuôi cấy mô

Phương pháp nhân giống in vitro thực chất là một tiến bộ vượt bậc của các phương pháp nhân giống vô tính cổ điển như giâm cành, giâm chồi, chiết, ghép, tách dòng… Ở đây giá trị thực tiễn của các tiến bộ khoa học kỹ thuật là đã biến những phương thức cổ điển đó thành những phương thức hoàn toàn mới về chất cho phép giải quyết những khó khăn mà phương pháp cổ điển không thể vượt qua. Ví dụ: kỹ thuật giâm cành chỉ có thể ứng dụng thành công ở một số cây trồng nhất định, vì rằng với kích thước 5-20 cm khả năng tạo rễ phụ của vùng mô thượng tầng gần vết cắt hoặc khả năng đánh thức chồi phụ vẫn bị các vùng tế bào lân cận và toàn bộ phần còn lại của đoạn giâm khống chế. Nếu tiến hành nuôi cấy mẫu mô với kích thước 5-10 mm, tức là làm giảm thể tích khối mô xuống 103 lần thì rõ ràng mối tương tác giữa các tế bào và các loại mô sẽ đơn giản đi rất nhiều, hiệu quả tác động của các biện pháp nuôi cấy sẽ phải cao hơn. Sau đây là một số phương thức nhân giống in vitro:

2.1. Tái sinh cây mới từ những cấu trúc sinh dưỡng
2.1.1. Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh hay đỉnh phân sinh

Phương thức này sử dụng các bộ phận nhỏ nhất của đỉnh chồi (shoot-tip) hay đỉnh sinh trưởng (apex) làm mẫu vật nuôi cấy. Nó bao gồm mô phân sinh đỉnh (apical meristem) và các mầm lá non (young leaf primordia). Khái niệm mô phân sinh đỉnh (ngọn) chỉ đúng khi mẫu vật được tách từ đỉnh sinh trưởng có kích thước trong vòng 0,1-0,15 mm tính từ chóp sinh trưởng. Trong thực tế mẫu vật được tách với kích thước như vậy chỉ khi nào người ta tiến hành nuôi cấy với mục đích làm sạch virus (virus-free) cho cây trồng. Thường sẽ gặp khó khăn lớn trong việc nuôi thành công các mô phân sinh đỉnh riêng rẽ có kích thước nhỏ như vậy. Do đó, trong khuôn khổ nhân giống in vitro người ta thường nuôi cấy cả đỉnh chồi hoặc đỉnh sinh trưởng. Phổ biến nhất ở các đối tượng như phong lan, dứa, mía, chuối… đỉnh sinh trưởng được tách với kích thước từ 5- 10 mm, nghĩa là toàn bộ mô phân sinh đỉnh và một phần mô xung quanh.

Tương quan giữa độ lớn của chồi nuôi cấy, tỷ suất sống và mức độ không thay đổi về mặt di truyền của chồi được bộc lộ như sau : Nếu độ lớn tăng thì tỷ suất sống và tính không thay đổi tăng, nếu độ lớn giảm thì tỷ suất sống và tính không thay đổi giảm. Nhưng xét về hiệu suất cao kinh tế tài chính nuôi cấy ( thể tích bình nuôi, lượng dung dịch thiên nhiên và môi trường dinh dưỡng ) : Nếu độ lớn tăng thì hiệu suất cao kinh tế tài chính giảm, nếu độ lớn giảm thì hiệu suất cao kinh tế tài chính tăng. Do đó, phải phối hợp hòa giải được những yếu tố trên để tìm ra phương pháp lấy mẫu tối ưu .
Một đỉnh sinh trưởng nuôi cấy ở điều kiện kèm theo thích hợp sẽ tạo một hay nhiều chồi và mỗi chồi sẽ tăng trưởng thành một cây hoàn hảo. Xét về nguồn gốc của những cây đó có ba năng lực :
– Cây tăng trưởng từ chồi đỉnh ( chồi ngọn ) .
– Cây tăng trưởng từ chồi nách phá ngủ .

– Cây phát triển từ chồi mới phát sinh, ví dụ: nuôi cấy đoạn trụ dưới mầm (hypocotyl) của cây mãng cầu (Annona squamosa) sẽ cho xuất hiện rất nhiều mầm (buds) trên mô nuôi cấy, một số mầm sau đó sẽ phát triển thành chồi (shoots) và trở thành cây in vitro hoàn chỉnh (plantlet). Tuy nhiên, thông thường khó phân biệt được chồi phá ngủ và chồi phát sinh mới. Các phương thức phát triển cây hoàn chỉnh từ đỉnh sinh trưởng nuôi cấy như sau:

– Phát triển cây trực tiếp

Chủ yếu ở các đối tượng hai lá mầm (dicotyledon) như khoai tây, thuốc lá, cam chanh, hoa cúc… Ví dụ: Khoai tây (Solanum tuberosum):

Mầm ( đỉnh sinh trưởng ) → Chồi nách → Cây
– Phát triển cây trải qua quá trình protocorm
Chủ yếu gặp ở những đối tượng người dùng một lá mầm ( monocotyledon ) như phong lan, dứa, huệ … Cùng một lúc đỉnh sinh trưởng tạo hàng loạt protocorm ( proembryo ) và những protocorm này hoàn toàn có thể liên tục phân loại thành những protocorm mới hoặc tăng trưởng thành cây hoàn hảo. Bằng phương pháp này trong một thời hạn ngắn người ta hoàn toàn có thể thu được hàng triệu thành viên, ví dụ : Hoa lan ( Orchidaceae ) :
Đỉnh sinh trưởng → Protocorm → Cây

Các đối tượng hoa lan đã mang lại hiệu quả kinh tế đặc biệt cao. Sau những kết quả đầu tiên ở chi Cymbidium của Morel (1966) người ta đã thu được kết quả rất tốt ở 22 chi khác nhau của họ này. Sở dĩ nhân giống vô tính hoa lan đạt được thành công lớn và được ứng dụng rộng rãi như vậy là vì hoa lan có phương thức sinh sản qua protocorm. Nhờ có phương thức nhân giống nhanh và rẻ tiền mà hoa lan vốn đắt trở nên có giả phải chăng và được nhiều người ưa chuộng. Những thành công ở họ lan không những chỉ là bằng chứng mà còn mở đường cho việc ứng dụng kỹ thuật này đối với các loài cây khác.

Lĩnh vực ứng dụng mới đây nhất cũng đã bắt đầu có kết quả là các cây ăn quả và cây lâm nghiệp, trong đó có các cây quý như cà phê, táo, lê, thông, bồ đề… Tổng số có trên 30 chi khác nhau đã được nuôi cấy thành công. Vì rằng, các cây trồng rừng và các cây ăn quả là những cây trồng lâu năm nên mọi chi phí ban đầu trong nhân giống in vitro đều có thể chấp nhận được.

– Ghép đỉnh chồi ( shoot apex grafting ) hay vi ghép
Về nguyên tắc, vi ghép là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, nhưng trải qua dinh dưỡng tự nhiên của gốc ghép. Đỉnh sinh trưởng dùng làm mắc ghép có kích cỡ khoảng chừng từ 0,2 – 0,5 mm, được tách từ búp non đang sinh trưởng mạnh của cây mẹ trưởng thành, gốc ghép là mầm giá mới nảy mầm từ hạt của giống hoang dại, hàng loạt cây ghép được nuôi dưỡng trong điều kiện kèm theo ống nghiệm vô trùng. Phương thức này thường dùng để tạo ra những giống cây ăn quả sạch bệnh virus nhằm mục đích cung ứng mắt ghép và cành chiết đầu dòng làm nguyên vật liệu nhân giống cho sản xuất đại trà phổ thông. Phương thức này được cho phép thu được cây trọn vẹn sạch bệnh và mang đặc thù di truyền của cây mẹ cho mắt ghép .
Có nhiều cách ghép khác nhau, ví dụ điển hình : ( 1 ) Ghép lên mặt phẳng cắt : đặt mắt ghép trực tiếp lên mặt phẳng lát cắt, trên vùng tượng tầng. ( 2 ) Ghép chữ T-ngược : dùng đầu nhọn của lưỡi dao cắt lỗ ghép hình chữ T-ngược, chân chữ T là mặt phẳng cắt để dễ thể hiện vùng tượng tầng. ( 3 ) Ghép miệng ếch : khoét trên thân mầm cách mặt phẳng cắt 5 mm một vết lõm hình miệng ếch, chiều sâu vết lõm bằng chiều dày lớp vỏ. Đặt mặt ghép vào đáy miệng ếch ( Hình 4.1 ) .
2.1.2. Nuôi cấy chồi bất định ( adventitious shoot culture )
Hệ thống nuôi cấy này có những nhu yếu tương tự như với nuôi cấy mô phân sinh đỉnh, nó chỉ khác về nguồn vật mẫu và nguồn gốc bất định của những chồi mới. Đỉnh chồi bất định mới hoàn toàn có thể tăng trưởng hoặc trực tiếp trên vật mẫu hoặc gián tiếp từ mô callus, mà mô callus này hình thành trên mặt phẳng vết cắt của vật mẫu. Một số loại vật mẫu được dùng như sau :
– Đoạn thân : thuốc lá, cam, chanh, cà chua, bắp cải …
– Mảnh lá : thuốc lá, cà chua, bắp cải, cafe, ca cao …
– Cuống lá : thủy tiên …
– Các bộ phận của hoa : súp lơ, lúa mì, thuốc lá …
– Nhánh củ : họ hành, họ lay ơn, họ thủy tiên …
– Đoạn mầm : măng tây .
Sự phát sinh chồi bất định trực tiếp khởi đầu bằng những tế bào nhu mô ( parenchyma cells ) nằm ở trong biểu bì hoặc ngay phía dưới mặt phẳng của thân ; 1 số ít tế bào này trở thành mô phân sinh và những túi nhỏ gọi là thể phân sinh ( meristemoids ) tăng trưởng. Các thể phân sinh này rõ ràng có nguồn gốc từ những tế bào đơn. Tuy nhiên, khunh hướng phản ứng của thực vật cũng tùy thuộc vào nồng độ phytohormone. Nghiên cứu sự tạo chồi ở mô nuôi cấy của cây linh samDouglas cho thấy cytokinin ( BAP 5 μM ) thiết yếu cho sự phát sinh chồi bất định, nhưng có ba kiểu phản ứng khác nhau có tác dụng tùy thuộc vào nồng độ của auxin được cung ứng. Nồng độ auxin thấp ( NAA 5 μM ) lá mầm tạo ra cả callus và nhiều chồi. Khi cung ứng chỉ riêng auxin ( NAA = 5 μM ) thì chỉ có callus được tạo thành .
Sự tăng trưởng những chồi bất định gián tiếp tiên phong qua quy trình tiến độ hình thành callus cơ sở ( basal callus ) từ những chồi được tách trong nuôi cấy. Các chồi sau đó tăng trưởng từ ngoại vi mô callus và không có quan hệ khởi đầu với những mô có mạch dẫn ( vascular tissue ) của vật mẫu. 2.2. Nhân giống trải qua tiến trình callus

Trong khuôn khổ của mục đích nhân giống in vitro nếu tái sinh được cây hoàn chỉnh trực tiếp từ mẫu vật nuôi cấy ban đầu thì không những nhanh chóng thu được cây mà các cây cũng khá đồng nhất về mặt di truyền. Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp mô nuôi cấy không tái sinh cây ngay mà phát triển thành khối callus. Tế bào callus khi cấy chuyển nhiều lần sẽ không ổn định về mặt di truyền. Để tránh tình trạng đó nhất thiết phải sử dụng loại callus vừa phát sinh, tức là callus sơ cấp để tái sinh cây thì hy vọng sẽ thu được cây tái sinh đồng nhất. Thông qua giai đoạn callus còn có thể thu được những cá thể sạch virus như trường hợp của Kehr và Sehaffer (1976) thu được ở tỏi.

2.3. Nhân giống trải qua phát sinh phôi vô tính-công nghệ phôi vô tính
2.3.1. Phôi vô tính

Một phương thức nhân giống vô tính nữa là tạo phôi vô tính từ tế bào mô sẹo. Năm 1958, Street và Reinert là hai tác giả đầu tiên mô tả sự hình thành phôi vô tính từ các tế bào đơn của cà rốt (Daucus carota). Đến năm 1977, Murashige cho rằng phôi vô tính có thể trở thành một biện pháp nhân giống in vitro. Ở một số loài, sự phát sinh phôi vô tính hình thành trực tiếp từ những phôi bất định (adventitious embryos) nằm trong phôi tâm (nucellar embryos). Đến nay, công nghệ phôi vô tính được coi là công nghệ rất có triển vọng cho nông nghiệp trong thế kỷ 21.

Phôi vô tính là những cá thể nhân giống ( propagules ) có cực tính bắt nguồn từ những tế bào soma. Chúng rất giống phôi hữu tính ( zygotic embryo ) ở hình thái, quy trình tăng trưởng và sinh lý, nhưng do không phải là loại sản phẩm của sự thụ tinh giữa giao tử đực và giao tử cái, và vì thế không có quy trình tái tổng hợp di truyền ( genetic recombination ), những phôi vô tính có nội dung di truyền giống hệt với những tế bào soma đã sinh ra chúng .

Ở trường hợp phôi hữu tính, sự kết hợp giao tử đực và cái cho ra hợp tử (zygote). Hợp tử phân chia nhiều lần tạo nên phôi hữu tính có cấu trúc hai cực: rễ và ngọn. Khi hợp tử phát triển, miền sinh trưởng rễ và miền sinh trưởng ngọn cùng phát triển và cuối cùng tạo thành cây hoàn chỉnh, qua các giai đoạn phôi học như sau:

  – Trường hợp cây hai lá mầm : Dạng cầu → dạng thủy lôi → dạng có lá mầm  
  – Trường hợp cây một lá mầm : Dạng cầu → dạng scutellar → dạng diệp tiêu  

STT

Tên khoa học Tác giả

1

CITRUS

Stevenson (1966), Rangan et al. (1968), Jumin et al. (1996)

2

THEOBROMA CACAO

Litz (1986), Alemanno et al.(1996)

3

COFFEA ARABICA

Sondahl and Sharp (1977), Boxtel et al. (1996)

4

COFFEA CANEPHORA

Berthouly et al. (1996), Boxtelet al. (1996)

5

HEVEA BRASILIENSIS

Carron and Enjalsic ( 1985 )

6

C. COGIENSIS

× C. CANEPHORA

Boxtel et al. (1996)

7

EUGENIA

Litz ( 1984 )

8

CAMELLIA SINENSIS

Ponsamuel et al. (1996)

9

MEDICAGO SUFFRUCTICOSA

Li et al. (1996)

10

SACCHARUM OFFICINARUM

Aftab et al. (1996)

11

DOCYNIA INDICA

Litz ( 1985 )

12

MALUS DOMESTICA

Eichholtz ( 1979 )

13

PICEA SITCHENSIS

Moorhouse et al. (1996)

14

MANGIFERA INDICA

Litz (1982), Pliego-Alfaro et al. (1996)

         

Trong việc sản xuất những hạt nhân tạo trải qua phôi vô tính từ nuôi cấy dịch lỏng, thì nồi phản ứng sinh học ( bioreactor ) là thiết bị không hề thay thế sửa chữa được .
Do phôi vô tính cũng hoàn toàn có thể nảy mầm và tăng trưởng thành cây hoàn hảo, nên kỹ thuật hạt nhân tạo đã được điều tra và nghiên cứu và ứng dụng thành công xuất sắc ở nhiều nước. Hạt nhân tạo gồm có 3 phần :
– Phôi vô tính
– Vỏ bọc polymer ( alginate )
– Màng ngoài ( calcium alginate )

Có nhiều loại polymer tự nhiên đã được thử nghiệm dùng cho công nghệ phôi vô tính, trong đó alginate được coi là tốt nhất. Alginate là một polymer sinh học, được chiết từ rong biển mà chủ yếu là các loài thuộc chi Sargassum. Aliginate do các phân tử manuronic acid gắn với nhau tạo thành, giống như các phân tử glucose tạo nên cellulose. Đặc điểm quan trọng nhất của alginate là chúng ở dạng hòa tan trong nước khi kết hợp với các ion hóa trị một (monovalent) như: Na+, K+, … và lập tức chuyển sang dạng không tan trong nước khi kết hợp với các ion hóa trị hai (divalent) hoặc đa hóa trị (polyvalent) như: Ca+4NH2+, Mg2+, Al3+,… Nếu nhỏ một giọt dung dịch sodium alginate vào dung dịch CaCl2 thì sodium alginate ở phần diện tích ngoài của giọt sẽ chuyển hóa ngay thành calcium alginate và tạo nên một màng không thấm nước. Các viên alginate được hình thành.

2.3.3. Nhân giống trong những nồi phản ứng sinh học
Trước đây, những nồi phản ứng sinh học hay còn gọi là nồi lên men ( fermentor ) đa phần được dùng cho công nghệ tiên tiến vi sinh. Trên cơ sở những thiết bị đó, với 1 số ít nâng cấp cải tiến, nhiều tác giả đã nhân giống thành công xuất sắc nhiều loại phôi vô tính và những thể chồi, cụm chồi hoặc củ nhỏ .
Phôi vô tính cafe được sản xuất thành công xuất sắc ở Brasil trên những nồi phản ứng sinh học dung tích từ 2-4 lít. Nồi quản lý và vận hành theo những nguyên tắc của một nồi lên men ( hoàn toàn có thể không dùng cánh khuấy mà chỉ dùng bọt khí để thực thi việc truyền khí và truyền nhiệt ). Mỗi mẻ hoàn toàn có thể thu được 4-5 triệu phôi vô tính cafe. Ở Indonesia, cụm chồi dứa được đưa vào sản xuất thành công xuất sắc với nồi lên men 10 lít. Điểm đáng quan tâm trong công nghệ tiên tiến này là thay vì bơm khí vào nồi phản ứng, dịch lỏng nuôi cấy ( môi trường tự nhiên mới ) được bơm vào nồi và hút ra ( môi trường tự nhiên cũ ) theo chu kỳ luân hồi ngắn, nhờ vậy mô và tế bào thực vật có đủ oxy và chất dinh dưỡng để tăng trưởng mạnh. Phương thức nuôi cấy này được gọi là nuôi cấy thể không thay đổi hóa tính ( chemostat culture ). Củ siêu bi ( microtuber ) được thị trường quốc tế công nhận là dạng khoai tây giống của thế kỷ 21. Củ khoai tây siêu bi có kích cỡ bằng hoặc nhỏ hơn hạt ngô, trọn vẹn sạch bệnh virus được công ty Microtuber Inc. ( Mỹ ) sản xuất trong những nồi phản ứng là những đoạn thân khoai tây nhân giống bằng cấy mô theo giải pháp cổ xưa. Trong nồi phản ứng, những đoạn thân được kích thích ra rễ và tạo củ nhỏ. Hiện nay, Microtuber Inc. có thị trường ở Bắc Mỹ và Hà Lan. Nồi phản ứng ở hãng Microtuber Inc. là những ống nhựa kín chịu nhiệt, đường kính 15 cm, dài 50 cm, quy trình tạo củ trọn vẹn không cần chiếu sáng .

Tóm lại, có ba phương thức tạo cây con trong nhân giống in vitro:

– Mẫu mô trực tiếp tạo chồi và cây hoàn hảo ( Hình 4.2 ) .
– Mẫu mô phát sinh callus và callus tạo chồi ( Hình 4.3 ) .
– Mẫu mô phát sinh callus, callus tăng trưởng phôi ( hoặc nuôi cấy dịch huyền phù tế bào phát sinh phôi ) và từ phôi thu được cây hoàn hảo ( Hình 4.4 ) .

3. Các giai đoạn trong quy trình nhân giống vô tính in vitro

Quy trình nhân giống vô tính in vitro được thực hiện theo 3 (hoặc 4-tùy theo cách phân chia của từng tác giả) giai đoạn:

– Cấy gây
– Nhân nhanh
– Chuẩn bị và đưa ra ngoài đất
3.1. Giai đoạn I-cấy gây
Đưa vật mẫu từ bên ngoài vào nuôi cấy vô trùng phải bảo vệ những nhu yếu sau :
– Tỷ lệ nhiễm thấp .
– Tỷ lệ sống cao .
– Tốc độ sinh trưởng nhanh .
Kết quả bước cấy gây này phụ thuộc vào rất nhiều vào cách lấy mẫu. Quan trọng nhất vẫn là đỉnh sinh trưởng, chồi nách, sau đó là đoạn hoa tự, hoa, đoạn thân, mảnh lá, rễ …
Chọn đúng giải pháp khử trùng sẽ cho tỷ suất sống cao và thiên nhiên và môi trường dinh dưỡng thích hợp sẽ đạt được vận tốc sinh trưởng nhanh .
Một số dạng môi trường tự nhiên dinh dưỡng thông dụng :
– Muối khoáng : Theo White ( 1943 ), Heller ( 1953 ), Murashige và Skoog ( 1962 ) .
– Chất hữu cơ :
+ Đường saccharose 1-6 % .

+ Vitamin: B1, B6, myo-inositol, nicotinic acid.

+ Acid amin : Arg, Asp, Asp-NH2, Glu, Glu-NH2, Tyr .

+ Phytohormone:

Theo nhập môn công nghệ sinh học của

Nguyễn Hoàng Lộc

Related Posts

Trả lời

Email của bạn sẽ không được hiển thị công khai.